Acemannano e fruttani contenuti nell’Aloe Vera come nuovi prebiotici (2017)

Oggi voglio proporti la traduzione della ricerca dal titolo " Acemannan and Fructans from Aloe vera (Aloe barbadensis Miller) Plants as Novel Prebiotics”.

Una ricerca pubblicata sia sul sito ufficiale dello IASC, sia sullo US National Library of Medicine.

Lo studio è stato condotto da:

· Maria Paz Quedaza (Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università del Cile / Dipartimento di Nutrizione, Facoltà di Medicina, Università del Cile)

· Carlos Salinas (Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università del Cile)

· Martin Gotteland (Dipartimento di Nutrizione, Facoltà di Medicina, Università del Cile)

· Liliana Cardemil (Dipartimento di Biologia, Facoltà di Scienze, Università del Cile)

Le proprietà nutraceutiche dell'Aloe vera sono state attribuite a un glucomannano noto con il nome di acemannano.

Recentemente sono state pubblicate informazioni sulla presenza di fruttani nell'aloe vera, ma non ci sono pubblicazioni su acemannano e fruttani come composti prebiotici.

Questo studio ha preso in indagine, in vitro, le proprietà prebiotiche di questi polisaccaridi.

I nostri risultati hanno dimostrato che i fruttani dell'aloe vera inducevano una crescita batterica migliore dell'inulina (FOS commerciale).

L'acemannano stimolò la crescita batterica meno dei fruttani e tanto meno il FOS commerciale. Utilizzando qPCR per studiare la popolazione batterica delle feci umane fermentate in un bioreattore che simula le condizioni del colon, abbiamo scoperto che i fruttani inducono un aumento della popolazione di Bifidobacterium spp.

I fruttani producevano maggiori quantità di acidi grassi a catena corta (SCFA), mentre gli acidi grassi a catena ramificata (BCFA) non aumentavano con questi polisaccaridi.

L'Acemannano ha aumentato in modo significativo le concentrazioni di acetato.

Pertanto, entrambi i polisaccaridi di Aloe vera hanno potenziali prebiotici.

Il gel di Aloe Vera contiene vari polisaccaridi, incluso un glucomannano acetilato noto come acemannanno, che è il polisaccaride più abbondante. Il mannosio costituisce la spina dorsale del polisaccaride intercettato con unità di glucosio. Il mannosio e il glucosio sono legati da legami glicosidici β-

In questo studio abbiamo studiato le proprietà prebiotiche di fruttani e acemannano; quest'ultimo presenta proprietà antibatteriche, antinfiammatorie e cicatrizzanti.

È sorprendente come i fruttani siano stati scoperti solo recentemente nell’Aloe vera, considerando che questa pianta appartiene al gruppo monocotiledoni, i cui membri sintetizzano generalmente questi polisaccaridi.

Figura 1. Strutture di polisaccaridi dalle piante di Aloe Vera.

(I) Acemannano. Un gruppo acetilico è evidenziato all'interno di una linea rossa.

(II) Fruttani trovati in piante di Aloe vera. L'unità di saccarosio terminale (glucosio + fruttosio) è mostrata in rosso.

I fruttani si trovano nella parte verde del tessuto fogliare (corteccia fogliare) delle piante di Aloe Vera. Recentemente abbiamo riferito che la struttura molecolare dei fruttani di Aloe cambia quando le piante sono sottoposte a stress idrico.

Dalle analisi GC-MS dei legami glicosidici, abbiamo osservato che le piante ben idratate di Aloe vera sintetizzano inulina e neoinulina come fruttani; mentre le piante soggette a deficit idrico sintetizzano anche i fruttani ramificati, i neo-fruttani.

I fruttani delle piante stressate hanno un più alto grado di polimerizzazione. Anche le quantità di fruttani e acemannano sono aumentate nella pianta sottoposta a stress idrico.

I prebiotici promuovono la crescita di popolazioni batteriche benefiche come le specie Lactobacillus e Bifidobacterium nel colon, accompagnate dalla produzione di acidi grassi a catena corta (SCFA) attraverso processi di fermentazione.

Questi eventi sono stati associati a un minor rischio di malattie croniche non trasmissibili, inclusi alcuni tipi di cancro come il cancro del colon-retto.

I prebiotici più studiati sono gli inulina oligosaccaridi e i galattooligosaccaridi; mentre l'uso di acemannano e fruttani da Aloe vera come prebiotici è stato scarsamente studiato, e non ci sono studi sul potenziale prebiotico dei fruttani sintetizzati dalle piante di Aloe vera sottoposte a stress idrico. C'è solo una recente pubblicazione sul gel di foglie di aloe vera come prebiotico.

Lo scopo di questo studio era di determinare il potenziale prebiotico di acemannano e fruttani (soli e combinati). Abbiamo anche determinato l'effetto di questi polisaccaridi sulle popolazioni batteriche delle feci umane e nella sintesi degli SCFA prodotti durante la fermentazione delle feci umane.

Materiali e metodi

Materiale vegetale

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con piante di Aloe barbadensis Miller (Aloe vera) coltivate in Cile. Le piante sono state irrigate con una capacità di campo del 25%, sottoposte a un grave deficit idrico. Avevano un anno di età quando venivano usati per l'estrazione del polisaccaride. Le foglie mature di quattro piante diverse sono state rimosse e conservate a -80 ° C.

Estrazione di polisaccaridi

Per l'estrazione dei polisaccaridi, le foglie intere sono state scongelate a 4 ° C e pulite con una soluzione disinfettante di ipoclorito di sodio (50 mg / L). È stato necessario elaborare almeno 10 foglie (ottenute da 4 diverse piante) per ottenere la quantità di polisaccaridi necessaria per questo studio. La corteccia fotosintetica della foglia è stata separata dalla polpa o dal gel interno corrispondente al parenchima sotto una cappa a flusso laminare utilizzando materiale sterilizzato. Una volta separate le parti, i fruttani sono stati estratti dalla corteccia e l'acemannano dal gel, utilizzando diversi protocolli di estrazione.

Estrazione e Depigmentazione dei fruttani

Cinque grammi di foglia sono stati bolliti con 10 mL di etanolo all'80% (v / v) per 5 minuti in un bagno d'acqua. Il tessuto è stato omogeneizzato in un miscelatore UV pre-sterilizzato per 20-25 minuti, l'omogenato è stato centrifugato a 5000 giri al minuto per 5 minuti a temperatura ambiente e il surnatante è stato estratto e salvato. Il pellet è stato risospeso in etanolo all'80%, riscaldato nuovamente a 70 ° C sotto agitazione per 5 minuti e centrifugato a 5000 rpm per 5 minuti. I surnatanti sono stati miscelati e congelati a -20 ° C.

Il pellet è stato quindi risospeso in 10 ml di acqua deionizzata, riscaldata a 60 ° C per 15 minuti e centrifugata a 5000 giri al minuto per 5 minuti. Il surnatante è stato ritirato e questo passaggio è stato ripetuto una volta.

I surnatanti sono stati miscelati e depigmentati aggiungendo il 5% (p / v) di carbone attivo e mantenendo la soluzione sotto agitazione a temperatura ambiente per 15 ore. Quindi la miscela è stata centrifugata a 9000 rpm per 1 ora a 5 ° C e il supernatante è stato filtrato con i filtri Whatman N ° 1 e N ° 3 sotto vuoto.

Il Celite 560 (terra diatomea calcinata) di Sigma-Aldrich al 5% (p / v) è stato aggiunto al filtrato e lasciato sotto agitazione a temperatura ambiente per 15 ore. Dopo centrifugazione a 9000 rpm per 60 minuti a 5 ° C, il surnatante è stato raccolto e mantenuto congelato a -20 ° C fino al momento dell'uso.

Estrazione e Depigmentazione dell'Acemannano

Il gel congelato è stato tagliato in piccoli pezzi di circa 4 × 3 cm e posto in una soluzione di 0,5 M di KCl sotto leggera agitazione a temperatura ambiente per 4 ore. La soluzione pigmentata è stata scartata e i pezzi di gel sono stati omogeneizzati in un miscelatore (precedentemente sterilizzato sotto luce UV per 20-30 minuti) alla massima velocità.

La soluzione di gel è stata centrifugata a 8000 rpm per 30 minuti a 4 ° C e il surnatante raccolto e conservato a 4 ° C. Il pellet è stato risospeso in 50 ml di acqua distillata e agitato per 3 ore a temperatura ambiente. La soluzione è stata quindi centrifugata nelle stesse condizioni.

I surnatanti sono stati miscelati e depigmentati incubando con il 5% di Celite 560 (peso / volume) sotto agitazione a temperatura ambiente per 15 ore. La miscela è stata centrifugata a 9000 rpm per 1 ora a 4 ° C, il surnatante è stato prelevato e miscelato con carbone attivo 5% (p / v) e lasciato sotto agitazione a temperatura ambiente per 15 h, quindi centrifugato a 9000 rpm per 60 min a 5 ° C.

Il surnatante è stato recuperato e filtrato sotto vuoto. Il Celite e le fasi di filtrazione sono stati ripetuti quando la soluzione di gelamento è rimasta pigmentata. Due volumi di etanolo freddo al 100% sono stati aggiunti alla soluzione di acemannano filtrata e la miscela è stata incubata a -20 ° C durante la notte.

La soluzione è stata centrifugata a 9000 rpm a 5 ° C per 1 ora e il pellet è stato risospeso in acqua deionizzata (1:10, v / v).

I fruttani e le soluzioni di acemannano sono stati evaporati con un evaporatore rotante al loro volume minimo e liofilizzati.

Quantificazione di fruttani e acemannano

I fruttani sono stati quantificati usando un metodo di anthrone modificato ottimizzato per aumentare la sensibilità ai kestose. I fruttani sono stati anche analizzati e quantificati mediante analisi GC-MS. Per questo, gli standard di zuccheri di fucosio, arabinosio, xilosio, mannosio, galattosio e glucosio sono stati derivatizzati in alditolo acetato e utilizzati per eseguire le rispettive curve di calibrazione, passando da 0 a 600 μg. Gli standard di zucchero sono stati preparati con diluizioni seriali che vanno da 4.6667 μg / μL a 0.03733 μg / μL. Myo-inositolo (20 μg) è stato aggiunto come standard interno.

Il polisaccaride estratto è stato idrolizzato a monosaccaridi in TFA 2N per 60 minuti a 60 ° C e derivatizzato in riduzione di alditoli per-O-acetilati previa riduzione con sodio boroidruro (NaBH4). Gli alditoli acetati sono stati estratti in etil acetato e 4 mL di acqua. Cinquanta microlitri sono stati prelevati per l'analisi da GC-MS utilizzando una colonna Supelco SP-2380 (Sigma-Aldrich, 30 m x 0,25 mm x 0,20 um). GC-MS era un sistema Varian GC-MS con un'iniezione campione automatizzata (Varian CP-3800 GC con un campionatore automatico di liquidi CP-8400) accoppiato con una MS Varian Saturn 2200. Secondo questo metodo, il fruttosio si tautomerizza in mannosio e glucosio. Pertanto, il glucosio libero, come contaminante, non può essere quantificato.

L'acemannano è stato inizialmente quantificato utilizzando il reagente Congo Red. Una soluzione standard (2 mg / ml) di glucomannano di Konjac (Megazyme) è stata utilizzata per eseguire la curva di calibrazione, passando da 0 a 25 μg.

L'acemannano è stato anche quantificato mediante GC-MS usando la stessa procedura di derivatizzazione descritta per i fruttani, tranne che l'idrolisi acida è stata eseguita a 121 ° C per 90 minuti. Gli standard di zuccheri e il mio-inositolo erano gli stessi usati per l'analisi dei fruttani.

Fermentazione in vitro di polisaccaridi di Aloe vera con colture batteriche pure

Sono stati utilizzati quattro ceppi di Lactobacillus e Bifidobacterium appartenenti alla banca del ceppo dell'Institute of Nutrition and Food Technology (INTA) dell'Università del Cile. I ceppi sono stati isolati dal latte materno e campioni di feci infantili ottenuti da studi precedenti effettuati dal nostro laboratorio in Cile.

Le specie e i ceppi batterici di questo studio e la loro origine sono i seguenti: Lactobacillus fermentum L55-2-33, latte materno; Lactobacillus casei L54-2-33, latte materno; Lactobacillus plantarum L46-1-12, latte materno; Lactobacillus plantarum N223-3, feci di neonati sani; Bifidobacterium catenulatum N173-2, feci di neonati sani; Bifidobacterium longum N180-3, feci di neonati sani; Bifidobacterium bifidum N364-3, feci di neonati sani; Bifidobacterium animalis ssp. lactis BB-12, commerciale.

Fermentazione in vitro di polisaccaridi di aloe vera con batteri fecali umani

Le feci fresche di tre volontari sani (23-26 anni, indice di massa corporea tra 18 e 24,9 kg / m2 e senza precedente assunzione di antibiotici, prebiotici o probiotici) sono state raccolte in recipienti ermetici di plastica sterile che sono stati mantenuti refrigerati al 4 ° C in condizioni anaerobiche fino alla consegna al laboratorio.

Cinque grammi di feci sono stati omogeneizzati in mezzo di coltura ridotto (10% p / v) con uno stomacher e la sospensione è stata aggiunta alla nave di un bioreattore. Il terreno di coltura conteneva 5 g / L di estratto di lievito (MoBio), acido ascorbico 10 g / L, acetato di sodio 10 g / L, 5 g / L (NH4) 2SO4, 2 g / L urea, 0,2 g / L MgSO4, 0,01 g / L FeSO4 , 0,007 g / L MnSO4, 0,01 g / L NaCl, 1 mL / L Tween 80, 0,05 g / L emina, 0,5 g / L cisteina e i polisaccaridi di Aloe vera testati (10 g / L fruttani o 3g / L acemannano), pH 7.0.

La sospensione è stata incubata in atmosfera di azoto (condizioni anaerobiche) a 37 ° C al buio sotto costante agitazione per 48 ore. Il pH della sospensione in coltura è stato controllato regolarmente. I campioni sono stati ottenuti alla fine del periodo di fermentazione e conservati a -20 ° C. Le misurazioni sono state fatte in triplice copia.

Quantificazione del microbiota da feci umane per qPCR

Dai campioni di feci incubati nei bioreattori di ciascun individuo, è stato estratto il DNA genomico batterico. La concentrazione di DNA totale è stata determinata dall'assorbanza a 260 nm in uno spettrofotometro.

La purezza del DNA è stata determinata attraverso il rapporto di assorbanza 260 nm / 280 nm. I campioni ottenuti sono stati mantenuti a -80 ° C. Le popolazioni batteriche di Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. e sono stati determinati i batteri totali. Per questo, 10 ng di DNA sono stati amplificati utilizzando i corrispondenti primer di ciascuna popolazione batterica.

Risultati

La resa media è stata del 2,74% del peso secco per fruttani e del 9,36% del peso secco per l'acemannano.

I componenti dello zucchero acemannano rivelano che ci sono pochissimi contaminanti da zucchero, probabilmente dalle pareti cellulari. Il mannosio è il principale componente zuccherino dell'86,87% e il glucosio il 12,68%, seguito da arabinosio, 0,38% e galattosio 0,05% tutte le percentuali sono espresse in percentuale molare. Il mannosio è 6,85 volte la quantità di glucosio.

Un'analisi del polisaccaride mediante elettroforesi su gel di carboidrati di acemannano ha mostrato che il galattosio non era presente come componente di zucchero.

I risultati pubblicati dal nostro gruppo (11) indicano che la somma di saccarosio e fruttosio presente nei fruttani depigmentati è del 42%. Percentuali più basse di saccarosio e fruttosio sono state rilevate nel FOS commerciale, stimato a circa il 10%.

I risultati di questo studio confermano che i fruttani e l’acemannano contenuti nell’Aloe vera sono dei prebiotici molto promettenti, che non erano stati studiati in precedenza. La cinetica di crescita di singoli ceppi batterici, corroborata da qPCR di popolazione batterica e quantificazioni di SCFA, indica che i fruttani ramificati sono prebiotici migliori rispetto ai FOS commerciali, che sono un fruttano lineare.

PAMELA SANNA

Diploma di Laurea in Naturopatia presso il Centro Studi Ippocrate. Da sempre nel campo dei rimedi naturali utilizzati in modo professionale per la cura della salute e della pelle, studio l'Aloe Vera da più di 15 anni. Visita il mio profilo Linkedin oppure il canale Youtube.