Una valutazione dell'impatto degli estratti di aloe vera e di liquirizia sul decorso dell'infezione  da Paramyxovirus di tipo 1 [2017]

Paramyxovirus della parainfluenza sono tra le principali cause di malattie del tratto respiratorio inferiore nei bambini: il tipo 1 è la causa principale della laringo-tracheobronchite nei bambini, mentre il 3 causa polmonitebronchite in bambini minori di 6 mesi; il tipo 2 somiglia al tipo 1 come manifestazioni cliniche ma è meno virulento; il 4 è il più benigno.

Un nuovo studio promosso dallo Iascpubblicato a novembre 2017 sullo US National Library of Medicine ed è stato condotto da:

Tutti medici appartenenti al Dipartimento di Malattie del Pollame, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Warmia e Masuria, Olsztyn, Polonia.

Oggi andiamo a tradurre e a conoscere da vicino lo studio condotto dai medici polacchi che si intitola "An evaluation of the impact of aloe vera and licorice extracts on the course of experimental pigeon paramyxovirus type 1 infection in pigeons"

La progressiva diminuzione dell'efficienza delle droghe sintetiche ha spinto la ricerca sugli additivi fitofarmacologici con proprietà potenzialmente immunomodulatorie e anti-infettive. Malattie complesse con eziologia mista, incluso virale, rappresentano un problema crescente nei colombi domestici.

Lo scopo di questo studio era di determinare l'efficacia di varie dosi di estratti di aloe vera e di liquirizia sul decorso dell'infezione sperimentale di PPMV-1 nei piccioni. L'esperimento è stato condotto su piccioni divisi in 5 gruppi, tra cui un gruppo di controllo e 4 gruppi sperimentali,a cui sono stati somministrati per via orale aloe vera o estratti di liquirizia a 300 o 500 mg / kg di peso corporeo per 7 giorni dopo l'inoculazione sperimentale con PPMV-1. Al giorno 4, 7 e 14 dopo l'inoculazione, sono stati raccolti tamponi cloacali e campioni di organi da 4 volatili in ciascun gruppo.

I campioni sono stati analizzati per determinare il numero di copie di RNA PPMV-1. I risultati indicano che estratti di liquirizia e di aloe vera inibiscono la replicazione di PPMV-1 diminuendo i numeri di copie di RNA virali negli organi esaminati.

L'effetto più inibitorio è stato osservato nei piccioni che hanno ricevuto estratto di aloe vera a 300 mg / kg di peso corporeo, per i quali i numeri delle copie di RNA PPMV-1 erano circa 7 volte più bassi (cervello), 9 volte più bassi (reni) e 14 volte inferiori (fegato) rispetto al gruppo di controllo.

I risultati di questo studio indicano gli effetti potenzialmente antivirali degli estratti di aloe vera e di liquirizia nei piccioni infetti da PPMV-1. 

Introduzione

Le piante medicinali vengono utilizzate da millenni per la prevenzione e il trattamento delle malattie.

La popolarità dei trattamenti a base di erbe è diminuita considerevolmente quando sono state introdotte le droghe sintetiche (i medicinali chimici). Tuttavia, l'uso eccessivo di farmaci ha gradualmente aumentato la resistenza ai farmaci nei microrganismi patogeni. Per cui, negli ultimi anni, la diminuzione dell'efficacia e l'aumento dei costi di produzione dei farmaci hanno riacceso l'interesse dei ricercatori per le piante medicinali. Attualmente, circa il 25% dei farmaci contiene ingredienti vegetali.

L'aloe vera (Aloe barbadensis Miller) è stata usata come pianta medicinale per secoli ed è stata relativamente ben studiata. Studi recenti hanno notevolmente ampliato le nostre conoscenze sulle proprietà medicinali e le applicazioni dell'aloe vera.

Le piante succulente del genere Aloe appartengono alla famiglia dei gigli (Liliaceae). L'aloe vera viene coltivata per le sue foglie carnose che contengono principalmente lattice e gel. Il gel di aloe vera contiene dal 98,5 al 99,5% di acqua e 75 composti biologicamente attivi. I polisaccaridi rappresentano circa il 60% della frazione solida del gel di aloe vera. Il polisaccaride più importante è l'acemannano, che è uno dei più potenti immunomodulatori di origine vegetale.

L'aloe vera contiene antrachinoni, saccaridi, vitamine, enzimimineraliormoni responsabili delle sue proprietà antinfiammatorie, antibatteriche, antimicotiche e anticancerogene.

L'Aloe Vera inibisce l'attaccamento e l'ingresso del virus dell'influenza, del citomegalovirus, del virus dell'herpes umano e del virus della poliomielite nelle cellule ospiti.

Anche la liquirizia (Glycyrrhiza glabra) è una famosa pianta medicinale. Questa pianta erbacea appartiene alla famiglia delle leguminose (Fabaceae) ed è stata usata nella medicina tradizionale per oltre 4.000 anni.

Analogamente all'aloe vera, la liquirizia dimostra un ampio spettro di proprietà, tra cui antiallergica, antidiabetica e anticancerogena. La radice di liquirizia è una ricca fonte di flavonoidi e saponine triterpeniche. Il principale ingrediente chimico è l'acido glicirrizico le cui concentrazioni nell'estratto di radice di liquirizia variano dall'1 al 9%. La glicirrizina ha proprietà anti-infiammatorie e antiossidanti.

Pompei et al. (1979) hanno dimostrato che l'acido glicirrizico inibisce la proliferazione di epatovirus A e B, virus dell'influenza e HIV.

Le erbe medicinali come l'aloe vera e la liquirizia sono ampiamente utilizzate come additivi per mangimi nell'alimentazione animale. Nei polli sono stati trovati additivi fitogeni fitofarmaci per migliorare l'aumento di peso corporeo, la composizione e la crescita del microbiota intestinale e la funzione immunitaria.

Gli effetti immunomodulatori degli estratti di aloe vera e di liquirizia non sono mai stati studiati nei piccioni, per quanto ne sappiamo. Le infezioni virali, in particolare le infezioni causate dal circovirus dei piccioni, pongono un problema crescente nella patologia dei piccioni.

Il genoma del paramyxovirus consiste di un singolo filamento di RNA di senso negativo che contiene circa 15.000 coppie di basi che codificano 6 proteine ​​strutturali. Le infezioni da APMV-1 possono produrre sintomi clinici diversi.

Il virus è stato classificato in 5 diversi patotipi: velogeno viscerotropico, velogeno neurotropico, mesogenico, lentogeno e asintomatico. I virus Velogenici sono più virulenti e causano perdite significative nelle popolazioni di uccelli.

Ad oggi, l'efficacia degli estratti di aloe vera e di liquirizia contro le infezioni da paramixovirus è stata studiata solo nei polli in base ai risultati di test di laboratorio standard che valutano i parametri biochimici del sangue, gli aumenti di peso e i livelli di anticorpi.

La malattia di Newcastle è una malattia soggetta a denuncia che deve essere legalmente segnalata alle autorità.

Materiali e metodi

Questo studio è stato condotto nel rigoroso rispetto della legge del 21 gennaio 2005 sulla sperimentazione animale e del regolamento del Ministro della Scienza e dell'Informazione Tecnologica del 29 luglio 2005 sul comitato nazionale per la sperimentazione animale. Il protocollo di ricerca è stato approvato dal comitato etico locale per la sperimentazione animale dell'Università di Warmia e Mazury a Olsztyn (autorizzazione n. 64/2014, valida fino al 26 novembre 2017). I ricercatori hanno fatto ogni sforzo per ridurre al minimo la sofferenza degli uccelli.

Virus

I piccioni sono stati infettati con il sierotipo 1 del peptide paramyxovirus ottenuto dal National Veterinary Research Institute di Puławy

Aloe Vera

L'estratto di aloe vera è stato ottenuto mediante congelamento / essiccazione a spruzzo del succo di foglie di aloe. Cinque grammi dell'estratto con il massimo contenuto di umidità dell'8% e densità apparente di 0,3-0,6 g / 1 ml sono stati ottenuti da 1.000 g di succo fresco di aloe vera.

Liquirizia

L'estratto secco di liquirizia è stato ottenuto mediante essiccazione a spruzzo di una soluzione acquosa di radice di liquirizia, che è un additivo per mangimi registrato (registro dell'Unione europea degli additivi per mangimi, gruppo 2b: prodotti naturali - definito botanicamente: CAS 68916-91-6 FEMA 2629, CoE 218 , ai sensi del regolamento (CE) n. 1831/2003).

L'estratto conteneva acido glicirrizico al 20% ed era caratterizzato da un contenuto di umidità massimo del 3,6% e densità apparente di 0,5 g / 1 mL.

Gli estratti di aloe vera e liquirizia erano esenti da batteri patogeni, come Escherichia coliStaphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.

Piccioni

Sessanta piccioni di 8 settimane sono stati tenuti da un allevatore privato. I volatili nella struttura di allevamento non era stato vaccinato contro PPMV-1 ed era privo di infezione.

Prima dell'esperimento, sono stati raccolti tamponi cloacali e campioni di sangue da tutti gli uccelli per escludere l'infezione da PPMV-1 con l'uso del metodo descritto di seguito e per determinare la presenza di anticorpi contro PPMV-1 con l'uso del kit di test ELISA commerciale.

Sono stati raccolti anche campioni di escrementi e campioni di escrezione da tutti gli uccelli allo screening di invasioni parassitarie o infezioni batteriche. È stata osservata la presenza di oocisti coccidi singoli e parassiti flagellati di Trichomonas gallinae. Batteri patogeni, PPMV-1 e anticorpi contro questo virus non sono stati rilevati. A causa di un minor rischio di invasioni parassitarie, i piccioni sono stati trattati con solfachloropirazina a 33 mg / 1 kg di peso corporeo (BW) per 3 giorni e ronidazolo a 9 mg / 1 kg di peso corporeo per 7 giorni.

Cinque giorni dopo la fine della terapia, sono stati ripetuti i test di parassitologia per determinare l'efficacia del trattamento. Gli uccelli sono stati alloggiati in unità isolate in una struttura di biosicurezza PCL3 del Dipartimento di Malattie del Pollame, Facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Warmia e Mazury a Olsztyn. L'impianto di biosicurezza è dotato di un sistema di filtrazione dell'aria particellare ad alta efficienza e di un sistema automatizzato per il controllo della pressione in corridoi, unità di uccelli e stazioni di igiene per prevenire la contaminazione di locali sperimentali. Ogni gruppo di piccioni era alloggiato in un'unità separata. Agli uccelli sono state somministrate miscele di semi e acqua durante l'esperimento.

Struttura dell'esperimento

I piccioni sono stati divisi in 5 gruppi di 12 uccelli ciascuno. Tutti i piccioni sono stati inoculati oculonalmente con 106 EID50 (dose infettiva del 50% di embrioni) di PPMV-1 a 100 μL per uccello (applicati alla narice e all'occhio a 50 μL ciascuno). Nel corso di 7 giorni post-inoculo (dpi), una soluzione acquosa di estratto di aloe vera è stata somministrata giornalmente a 300 mg / kg di peso corporeo (gruppo A) o 500 mg / kg di peso corporeo (gruppo B) e una soluzione acquosa di estratto di liquirizia è stato somministrato a 300 mg / kg di peso corporeo (gruppo C) o 500 mg / kg di peso corporeo (gruppo D).

Gli uccelli del gruppo di controllo (K) sono stati somministrati per via orale allo 0,9% di NaCl. Dopo 4, 7 e 14 giorni, i tamponi cloacali sono stati raccolti da 4 uccelli selezionati a caso in ciascun gruppo con l'uso del sistema di raccolta e trasporto ESwab. Gli uccelli sono stati sottoposti ad eutanasia e durante l'esame anatomopatologico sono stati raccolti campioni di tessuto cerebrale, renale, epatico e pancreas.



Isolamento dell'RNA

Campioni di organo di 0,2 g sono stati collocati in provette, inondati con 700 μL di PBS sterile e omogeneizzati nel sistema di disgregazione TissueLyser II. Gli organi omogeneizzati o 450 μL del liquido da tamponi sono stati centrifugati per 15 minuti a 2.000 x g. Il surnatante dagli organi omogeneizzati e dai tamponi è stato raccolto nella quantità di 350 μl per l'isolamento dell'RNA.

L'RNA è stato isolato con il kit RNeasy Mini secondo le linee guida del produttore. Le concentrazioni di RNA eluito sono state misurate con lo spettrofotometro NanoDrop 2000 e i campioni sono stati conservati a -80 ° C fino all'analisi successiva.

Quantitativo di PCR in tempo reale

La reazione di trascrizione inversa è stata effettuata con il kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità in base alle istruzioni del produttore. Prima e durante l'esperimento, la presenza e la quantità di materiale genetico PPMV-1 nei piccioni è stata determinata dalla PCR in tempo reale con l'uso di una sonda e primer specifici per il gene della proteina matrice, secondo il metodo sviluppato di Wise et al., (2004) e modificato da Cattoli et al. (2009).

La reazione è stata eseguita nel termociclatore e la miscela ha la seguente composizione: 10 μL di Master Mix PCR Universal Veloce TaqMan® (Life Technologies, Carlsbad, CA), 1.8 μL di 10 μM (PPMV-1-Forward 5-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3 e PPMV-1- Reverse 5-CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3) primer ciascuno, 0,24 μL di sonda LNA da 25 μM (acido nucleico bloccato) (5- Hex-GGGAcRgcHtGcTATcC-BHQ-3 - lettere minuscole indicano la posizione bloccata del nucleotide), 3,16 μL di acqua senza RNasi e 3 μL di cDNA.

La reazione è stata condotta nelle seguenti condizioni: attivazione della polimerasi a 95 ° C / 30 s, seguita da 40 cicli a due stadi di: denaturazione a 95 ° C / 15 s, ricottura dell'innesco e allungamento della catena a 56 ° C / 60 secondi. Il numero di copie virali e la sensibilità di reazione sono stati determinati tracciando una curva standard.

Il primo stadio del processo prevedeva l'amplificazione di un prodotto di 1,195 bp contenente una sequenza nucleotidica corrispondente al frammento del gene codificante per la proteina di matrice PPMV-1 e la proteina di fusione, secondo il metodo descritto da Wise et al., (2004).

Il frammento amplificato conteneva sequenze compatibili con la sonda qPCR TaqMan e primer. La reazione è stata condotta in un termociclatore  e i seguenti primer: M629F: 5-TCGAGICTGTACAATCTTGC-3 e F581R: 5 -CTGCCACTGCTAGTTGIGATAATCC-3.

La miscela di reazione aveva la seguente composizione: 10 μL di DNA Polimerasi HotStarTaqPlus, 0,1 μL di primer 100 μM ciascuno, 7,8 μL di acqua senza RNasi e 2 μL di cDNA. La reazione è stata condotta nelle seguenti condizioni: 95 ° C / 5 min, seguita da 40 cicli di 94 ° C / 1 min, 58 ° C / 1 min, 72 ° C / 1 min e allungamento a catena a 72 ° C /10 minuti.

I residui di tampone e nucleotide sono stati rimossi dal prodotto risultante e la concentrazione dell'amplicone è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro. Il numero di copie del gene è stato calcolato in base alla concentrazione e alle dimensioni dell'amplicone con un calcolatore del numero di copie. Sono state utilizzate diluizioni seriali standard da 10 volte (diluizione iniziale: 108, diluizione finale: 103) di ampliconi come DNA del modello.

Analisi statistica

Il test non parametrico Kruskal-Wallis per campioni indipendenti è stato utilizzato per determinare differenze statisticamente significative tra i gruppi (A-K) in ciascun giorno di campionamento. Il test è stato anche utilizzato per valutare differenze statisticamente significative tra i giorni di campionamento in ciascun gruppo. Il test non parametrico di Mann-Whitney U è stato eseguito per confrontare 2 gruppi indipendenti: il gruppo sperimentale (A-D) e il gruppo di controllo (K). Le differenze sono state considerate significative a P <0,05 e altrettanto significative a P <0,01.

Risultati

L'infezione sperimentale era mite e gli uccelli non presentavano sintomi clinici, ad eccezione degli escrementi acquosi, osservati dopo 7 giorni. Le morti non sono state osservate in nessuno dei gruppi studiati. 

La quantità di RNA del paramyxovirus era più bassa a 4 giorni e più alta a 7 giorni. La tendenza di cui sopra è stata osservata nella maggior parte dei campioni, ma le differenze osservate non erano statisticamente significative in tutti i casi.

Differenze significative (P <0,05) tra il campionamento sono state trovate in campioni di cervello da gruppi AD, campioni di rene da gruppi C, D e K, campioni di fegato da gruppi A e K, campioni di pancreas da gruppi C e D e tamponi cloacali da gruppo A. Le differenze nei campioni cerebrali del gruppo K erano altamente significative (P <0,01).

Le uniche differenze significative (P = 0,002) nel numero di copie dell'RNA virale sono state trovate a 4 giorni in campioni di rene tra i gruppi sperimentali C e D rispetto al gruppo di controllo. Nel caso di altri organi, i numeri di copie di PPMV-1 erano generalmente più alti nei campioni di organi del gruppo K rispetto ai campioni di organi dei gruppi sperimentali a 7 giorni.

La tendenza di cui sopra era più pronunciata nel gruppo A in cui il numero di copie virali dell'RNA era circa 7 volte più basso (cervello, P = 0,17), 9 volte inferiore (reni, P = 0,30) e 14 volte inferiore (fegato, P = 0,16) rispetto al gruppo K. Una tendenza simile è stata osservata nei campioni di fegato del gruppo B rispetto al gruppo K. Nei gruppi C e D, la tendenza sopra era meno pronunciata, ma il numero di copie virali dell'RNA in campioni di reni e fegato era circa 4 volte inferiore (rene P = 0,30 e fegato P = 0,16) rispetto al gruppo K. Tali correlazioni non sono state trovate nei tamponi cloacali.

I risultati di questo studio indicano che sia gli estratti di aloe vera che di liquirizia inibiscono la replicazione di PPMV-1 nei piccioni. La dose di aloe vera di 300 mg / kg di peso corporeo è stata caratterizzata dalla più alta attività inibitoria. I nostri risultati suggeriscono che gli estratti di aloe vera e liquirizia possono essere utilizzati come additivi per mangimi durante il trattamento di supporto delle malattie virali nei piccioni. La modalità di azione degli estratti di aloe vera e di liquirizia non è stata completamente chiarita in nessuna specie di uccello; pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per determinare l'influenza di questi additivi nei mangimi su parametri immunitari selezionati in piccioni infetti da PPMV-1.



PAMELA SANNA

Diploma di Laurea in Naturopatia presso il Centro Studi Ippocrate. Da sempre nel campo dei rimedi naturali utilizzati in modo professionale per la cura della salute e della pelle, studio l'Aloe Vera da più di 15 anni. Visita il mio profilo Linkedin oppure il canale Youtube.